Merhabalar, bugün sizinle PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) yöntemini ve nasıl keşfedildiğini inceleyeceğiz.

Hücreler, bölünmenin hazırlık aşamasında genetik materyalini çoğaltır. PCR ise bu yolu taklit eden bir yöntem olarak 1983 yılında Kimyager Dr. Kary Banks Mullis tarafından bulunmuştur. PCR öncesinde belirlenen genetik materyali çoğaltmak uzun saatler sürerken şimdi laboratuvarlarda birkaç saatte çoğaltılabilir. Keşfi çok eskiye dayanmamasına rağmen teknolojiyle beraber çok hızlı bir şekilde gelişmiş ve günümüzde spesifik amaçlarla düşük hata payları ile kullanılabilmektedir. [1]

Tarihçesi:

1983 yılında çok sayıda ödüle sahip olan Kimyager Dr. Kary Banks Mullis tarafından keşfedilmiş olup 1993 Nobel Kimya Ödülüne laik görülmüştür.

Dr. Kary Banks Mullis, 1944’te Kuzey Carolina’ da doğmuştur. Lisansını kimya alanında yapmış olan Mullis, Yüksek Lisansı ve Doktorası boyunca Biyokimya alanında çalışmıştır. Ardından 1979’da ” oligonükleotid sentezi” üzerine araştırmalar yaparken polimeraz zincir reaksiyonunu keşfetmiştir. [2,3]

7 Ağustos 2019 tarihinde Amerika Birleşik Devletleri’nin California Eyaleti’nde hayatını kaybetmiştir. [4]

Polimeraz zincir reaksiyonu nasıl çalışır?

PCR, DNA replikasyonu’nun dış ortamda yapılan hali olduğundan bahsetmiştik. DNA replikasyonunda primer,DNA’nın belli bir bölgesine bağlanır. Primer 18-24 bazlık tek zincirli kısa bir DNA zinciridir. Bu primer, PCR mekanizmasında da kullanılmaktadır. Hücrede DNA’ya primer bağlandıktan sonra “DNA Polimeraz Enzimi” devreye girer ve DNA’yı kopyalamak için nükleotidleri takmaya başlar. PCR tüpüne eklenecek şeylerden biri de DNA polimeraz enzimi ve dNTP’lerdir. Hücrelerde replikasyon mekanizmasını çalıştırmak için çok sayıda enzim gerekir ancak PCR için bunlara gerek yoktur. PCR’da sıcaklıkla oynayarak enzimlerin yaptığı işleri yapmak mümkün hale gelir. [5,6]

PCR yapabilmek için öncelikle çift zincirli bir DNA’nızın olması gerekir. Vücutta replikasyon sırasında “DNA Helikaz Enzimi” kullanılır ancak PCR’da bunu sağlayan yüksek sıcaklıktır. Sıcaklık yaklaşık 93-96 °C’ ye çıkartılır, bu sayede nükleotidler arasındaki hidrojen bağı açılır. Hidrojen bağları açıldıktan sonra,çoğaltılmak istenilen bölgeye bağlanacak olan özgül 2 adet primer (forward ve reverse) sisteme eklenir. Bu noktada primerin özgül olması önemlidir. Özgül olmazsa başka bölgelere de bağlanıp yanlış DNA bölgelerinin çoğalmasına neden olabilir.

Primer tasarlamak için birkaç kural vardır;

  • Primer çok uzun veya kısa olmamalıdır. (18-24 baz)
  • Erime sıcaklığı doğru ayarlanmalıdır. (54-72 °C ) Eğer yanlış sıcaklık kullanılırsa primer çalışmayacaktır. Hesaplama için şöyle bir formül uygulanmaktadır:

𝑇𝑚=2(𝐴+𝑇)+4(𝐺+𝐶)

  • Primerin kendi üstüne katlanmayan özellikte olması gerekir. (hairpin)
  • Primer çok fazla tekrar dizisi içermemelidir. Çok fazla tekrar dizisi primerin kararsızlığı artar.
  • Guanin-Citosin (G-C) oranı %45 ile %55 arasında olmalıdır. Yüksek G-C oranı erime sıcaklığının çok yükselmesine neden olabilir.

Primer eşleşmesinin ardından gerçekleşmesi gereken aşama, DNA Polimeraz enziminin bağlanıp 5’ uçtan 3’ ucuna doğru nükleotitleri takıp DNA’yı eşlemesidir. Deneylerde genellikle “Taq DNA Polimeraz Enzimi” kullanılmaktadır. Ayrıca ortama DNA Polimeraz’ın yeni zinciri oluşturabilmesi için dNTP’ler eklenmelidir. Ortama eklenen dNTP’lerin oranının eşit olması gerekir. Eşit olmazsa DNA çoğalması sırasında sorun yaşanabilir.

En önemlisi ise tepkime in vitro yani dış ortamda gerçekleştiği için ortama tampon eklenmesidir. Tampon eklenmesinin nedenleri ise ortam pH değerini ayarlamak, DNA’nın bozunmasını engellemek ve tepkimenin doğru bir şekilde gerçekleşmesini sağlamaktır. Özellikle tamponda Mg+2 iyonu olması önemlidir. Magnezyum iyonu, polimeraz aktivitesini ve “Primer – Hedef DNA Etkileşimi” değeri olan Tm’yi arttırır.

PCR döngüler halinde gerçekleştirilir, her döngüde DNA miktarı 2n olarak artar. 20-30 döngü sonunda istenen miktarda DNA elde edilmiş olur. Eğer istenen miktardan az DNA elde edilmişse döngü sayısını arttırmak yerine örnek miktarı arttırılmalıdır. Döngü sayısının çok olması reaksiyonu bozar ve deney hatalı sonuç verebilir. [5,6]

Günümüz teknolojisinin gelişmesiyle beraber farklı PCR tipleri de gelişmiştir. [7]

  • Nested –seminested PCR
  • Multiplex PCR
  • RT-PCR
  • Touchdown PCR
  • Inverse PCR
  • Allele specific PCR
  • Asymmetric PCR
  • Arbitrary PCR
  • Core sample PCR
  • Degenerate PCR
  • Assembly PCR
  • Dial-out PCR
  • Digital PCR
  • Traditional PCR
  • Hot start PCR
  • In-silico PCR
  • Inter sequence PCR
  • Ligation-mediated PCR
  • Methylation- specific PCR
  • Miniprimer PCR
  • Nano particle PCR
  • Overlap-extension PCR
  • Quantitative PCR
  • Solid phase PCR
  • Suicide PCR
  • Thermal asymmetric interplaced PCR
  • Semiquantative PCR
  • Conventional PCR
  • Colony PCR
  • After exponentional PCR
  • Standard PCR
  • Qualitative PCR

Yaygın olarak kullanılan PCR tipleri ise standart PCR, Q-PCR ve RT-PCR’dır.
Bir sonraki yazımda yaygın kullanılan PCR tiplerinin ortaya çıkışı, mekanizmaları ve nerelerde kullanıldığını inceleyeceğiz.
Takipte kalın.

Kaynakça:


[1] Encyclopedia Britannica , Polymerase Chain Reaction (17.04.2020 tarihinde erişilmiştir.)
[2] The Nobel Prize,Karry B. Mullis (17.04.2020 tarihinde erişilmiştir.)
[3] Karry Mullis,Biography (17.04.2020 tarihinde erişilmiştir.)
[4] Encyclopedia Britannica,Karry Mullis (20.04.2020 tarihinde erişilmiştir.)
[5] Somma, M. Querci, M. Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri, Bölüm 6
[6] Kahya, S. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Optimizasyonu, Uludag Univ. J. Fac. Vet. Med. 32 (2013), 1: 31-38
[7] Rajalakshmi, S. Different Types Of PCR Techniques And Its Applications, IJPCBS 2017, 7(3), 285-292