Yaşamın dinamik doğası, bilimsel arayışlarla ve teknolojinin hızla gelişmesiyle her geçen gün giderek daha belirgin hale gelmektedir. Yaşamsal süreçte sürekli olarak üretilen metabolitlere ek olarak, proteinler, ribozomlar ve hücresel organellerin kendi yaşamları arasında sentez ve degradasyon ile dengede tutulur. Bu dengenin korunması için hücreler sürekli olarak bulundukları çevreden kimyasal madde almalı ve bu maddelerle enerji sağlamaları gerekmektedir. Hayvanlarda bu kimyasal maddenin en önemlisi,yiyecekler ile dışarıdan alınan proteinlerdir ve bunların sindirilmesi ile açığa çıkan enerji yaşamsal aktivitenin devam ettirilmesinde kullanılan önemli bir yapı taşıdır. Dünya üstüdeki istisnasız tüm canlıların proteinleri sindirebilmek için proteaz enzimlerine sahip olması, aslında bu mekanizmanın evrimin çok erken dönemlerinde hücre içi protein yıkıcı bir sistem edinmiş olmasından kaynaklanmaktadır. Hücreler enerji eldesi için protein yıkımına milyonlarca yıl önce ihtiyaç duymuş ve hala hücrede kullanılan bir sistem olsa da ayrım gözetmeyecek şekilde bozulması, hiç istemediğimiz gereksiz enerji israfına neden olabilir. Bu sorunu çözmek için hücre içerisinde geliştirilmiş mekanizmalar bulunmaktadır. Bunlar proteaz aktivitesinin yapısal özelliklerinden kaynaklı bozunma aktivetesini sınırlandırmak, enzimin sıkı bir şekilde denetlenmesi ve düzenlenmesi şeklinde yapılabilir[1] .

LİZOZOMUN KEŞFİ VE FONKSİYONLARI

Hücre içi protein sindirim mekanizmalarını Belçikalı sitolog Christian De Duve tarafından 1950’li yıllarda lizozomun keşfedilmesi ile anlaşıldı. Chistian De Duve lizozom ve peroksisomların yapısını keşfettiği için 1974 yılında Nobel Fizyoloji ve Tıp Ödülü’nü almıştır. Neredeyse tüm ökaryotik hücrelerde bulunan lizozom organeli makro moleküllerin, eski hücre parçalarının ve mikroorganizmaların sindirilmesinden sorumludur. Her bir lizozom organeli iç kısmındaki asidik ortamı proton pompası yolu ile koruyan bir zar ile çevrilirdir. Bu organel aynı zamanda çok çeşitli hidrolitik enzimler ile (asit hidrolazlar) nükleik asitleri, proteinleri ve polisakkarit gibi makro molekülleri parçalayabilmektedir. Bu enzimlerin sadece lizozom asidik yapısı içerisinde aktif oluşu ise sızıntı vb. durumlarda hücreyi kendi kendine bozunması/sindirmesine karşı korur (Hücre içi pH nötr-hafif alkali yapıdadır.)[2] . Parçalanan lizozomal sindirim ürünlerinin (aminoasitler, nükleotitler vb.) çoğu hücre bileşenlerinin sentezinde makro moleküllerin inşası için tekrar kullanılmak üzere geri dönüştürülür. Dolayısıyla bu parçalanma ATP üretimi yolu ile enerji verimliliğini de destekleyen ve fonksiyonel olarak işlev görmeyen protein ya da organelleri çıkararak hasar kontrolüne aracılık eden hücresel bir geri dönüşüm fabrikası olarak işlev görür. Bu geri dönüşüm otofaji adlandırılmaktadır. Peki bu süreç moleküler düzeyde nasıl düzenlenir ve ne demektir onlara bakalım[3].

Şekil 1: Hücrelerimizde birbirinden farklı, özelleşmiş yapılar bulunur. Lizozomlar bu yapılardan biridir ve hücre bileşenlerinin sindirimi için gerekli enzimler içerirler. 1960’larda yapılan gözlemlerde otofagozom adı verilen yeni bir kesecik tipi keşfedilmişti. Otofagozom oluşurken işlevsiz hücresel bileşenleri, zarar görmüş proteinleri içine alır. Son aşamada yapı lizozomla birleşir ve otofagozomun içindeki atık hücre bileşenleri daha küçük parçalara ayrılır. Bu süreç hücreye beslenme ve yenilenme için gerekli yapı taşlarını sağlıyor [1A].
Şekil 2: Otofaji mekanizmasını gösteren şematik çizim.

OTOFAJİ NEDİR? FİZYOLOJİK ROLLERİ NELERDİR?

Lizozom’a sitoplazmik bileşenler sağlayan hücre içi bir bozunma, besin stresine karşı yanıt olarak enerji kaynaklarının kritik dengelenmesi için önemli bir kendini parçalama sistemidir. Otofaji terimi, lizozomun keşfinden kısa bir süre sonra Christian De Duve tarafından ortaya atılmıştır. Duve elektron mikroskopisi tekniği ile sıçan karaciğer hücrelerinin kendi bileşenlerini zar ile çevreleyip kese benzeri yapılar oluşturduğunu ve daha sonra bu keseleri lizozom adlı geri dönüşüm birimine taşıdığını gözlemledi. Hücre içi bileşenlerinin lizozoma iletiminin yolu olarak otofaji terimini ve taşınmada görevli bu kese benzeri veziküllere ise otofagosom olarak adlandırdı.

Şekil 3: Yonshinori Ohsumi [1A]

Yunanca’da “kendi kendini yemek” anlamına gelmektedir[5]. Bu mekanizmanın aydınlatılması ile ilgili ilk önemli adımlar 1990’lı yılların başında Yonshinori Ohsumi tarafından mayada (Saccharomyces cerevisiae) otofajinin keşfedilmesi ile yapılmıştır. Ohsumi maya hücrelerinin önemli hücresel yolakların tespit edilmesinde sıkça kullanılan ve nispeten daha kolay olduğundan bu organizmayı seçmiştir. Ancak maya hücreleri çok küçük olduğundan iç yapılarının mikroskop altında kolayca ayırt edilip incelenmesi işleri bir miktar zorlaştırmış olsa da bu sorunu maya hücreleri henüz otofaji sürecindeyken vakuol içindeki bozulma sürecini inhibe ederek, otofagozomların vakuol içerisinde birikmesi ve mikroskop altında görür hale gelmesini sağlayarak başarmıştır. Bu nedenle Ohsumi,”vakuol bozunma enzimleri” olmayan mutant maya kültürleri oluşturdu ve aynı zamanda hücreleri aç bırakarak otofajiyi tetikledi. Kültür bu şekilde bir kaç saat geçirdikten sonra sonuçta küçük veziküller ile doluydu. Bu veziküller otofagozomlar olduğundan Ohsumi,maya hücrelerinde otofaji gerçekleştiğini bu şekilde kanıtlamış oldu. Ancak bu sefer de otofojiyi kodlayan bu genlerin neler olduğu sorusunu sormuş ve “Mekanizmayı aktifleştiren genler etkisiz hale getirildiğinde birikim meydana gelmemeli” sonucundan yola çıkarak yeni bir deney hazırlamıştır. Bu genlerin anlaşılması için genleri rastgele mutasyona maruz bırakan bir kimyasal ile muamele etti ve ardından otofajiyi indükledi. Yapılan deneyler sonucunda Ohsumi otofaji için gerekli olan ilk genleri tespit etmiş oldu ve otofajinin mekanizmalarını aydınlattı. Şu anda 32 farklı otofaji ile ilişkili gen (Atg), mayalarda yapılan genetik taramalar ile tanımlanmıştır[3,4] . Bu genlerin filogenide ökaryotik canlılar arasında iyi bir şekilde korunduğu görülmektedir[1] . Ohsumi’ya maya ile yaptığı bu deneyle otofajinin temel önemini ve fonksiyonlarını aydınlatmasından dolayı 2016’da Nobel Ödülü’ne layık görülmüştür.

Maya hücresinde keşfedilen bu mekanizma insanlarda buna çok benzer bir mekanizma ile çalışmaktadır. İnsanlarda otofaji, hücre bileşenlerinin parçalanması ve geri dönüştürülmesi gibi önemli fizyoloji fonksiyonlarının yanı sıra açlık sırasında enerji için yakıt, hücresel bileşenlerin yenilenmesi için yapı taşlarının sağlanması ve diğer stres koşullarına verilen hücresel tepkiler için önemlidir. Enfeksiyon sonrası oluşan istilacı hücre içi bakteri ve virüslerin ortadan kaldırılmasında, embriyo gelişimi ve hücre farklılaşmasına katkıda bulunmaktadır. Hücreler yaşlanmanın olumsuz sonuçlarını ortadan kaldırmak için hasarlı protein veya organel yapılarını ortadan kaldırmada otofajiden yararlanırlar. Böyle önemli ve hayati işler üstlenen bu mekanizmanın bozulması ya da yokluğunda sorunlar çıkartmaktadır. Parkinson hastalığı gibi nörodejeneretif hastalıklar, tip 2 diyabet, yaşlanma ile ortaya çıkan diğer hastalıklar ve özellikle günümüzde pek çok kişinin yakalandığı kanserlerde de otofaji genlerinin mutasyon geçirmesi bozulmuş otofajik süreç ile ilişkilendirilebilir[4] .

Şekil 4: Mayada (solda) bulunan vakuol, memeli hücrelerindeki lizozoma karşılık gelir. Ohsumi yıkım için gerekli vakuol enzimlerinden yoksun mutant maya hücreleri oluşturdu. Bu maya hücreleri aç kaldığında otofagozomlar hızla vakuol içinde birikir (ortada). Ohsumi’nin deneyi otofajinin mayada da gerçekleştiğini kanıtladı. Sonraki adımda Ohsumi mutant mayayı (sağda) inceleyerek otofaji süreci için hayati önem taşıyan 15 geni belirledi [1A].

Şuana kadar tanımlanmış üç otofaji türü vardır. Bunlar makro otofaji, mikro otofaji ve şaperon aracılı otofajidir ve her üçüde lizozomda sitozolik bileşenlerin proteolitik degredasyonunu destekleyen mekanizmalardır[3] .

Şekil 5: A. Makrootofaji mekanizmasının şematik görüntüsü, B. Mikrootofaji mekanizmasının şematik görüntüsü, C. Şaperon bağımlı otofajinin şematik görüntüsü [2A].
Şekil 6: Otofaji çalışmalarının yıllara göre artış grafiği [1].

OTOFAJİYİ DÜZENLEYEN SİNYAL YOLLARI

Otofaji, çoğu hücre tipinde bazal seviyede aktivite gösteren bir mekanizmaya sahiptir. Bununla birlikte uzun süreli açlık durumlarında güçlü bir şekilde uyarılır ve besin yokluğuna verilen önemli bir tepkidir. Besinin algılanmasında ve hücre büyümesi ile ilgili otofajinin düzenlenmesinde en önemli molekül “target of rapamycin” (TOR) protein kinazıdır. Temel olarak TOR, besin duyarlı, hücre büyümesi ve yaşlanmanın kontrol merkezi olarak işlev görür. Besin ortamda olduğunda TOR kinaz, Akt kinaz, PI3-kinaz ve büyüme faktörü reseptöründen sinyal verilir ve ribozomal protein ekspresyonu ve artan protein translasyonu ile büyüme teşvik edilir. Bu sinyaller verildiği andan itibaren büyüme teşvik edilirken TOR otofajiyi inhibe etmek için harekete geçer. Buna Saccharomyces cerevisiae ve Drosophilla’da Atg1 kinaz aktivitesi üzerindeki inhibisyon etki ederken bu yapının memeli hücrelerinde nasıl gerçekleştiği henüz netleştirilememiştir. TOR kinaz, hipokside dahil olmak üzere besin yokluğunu algılayan sinyaller sayesinde baskılanır. TOR aynı zamanda rapamisinli hücreler ile de yapay olarak inhibe edilebilir. Böylece, azalmış TOR aktivitesi otofajiyi indükler ve yine hücrenin azalan büyüme ve artan katabolizma yoluyla değişen ortamına uyumunu sağlar[3].

OTOFAJİ ÇALIŞMALARINDAKİ ZORLUKLAR

Otofaji öncelikle elektron mikroskopisi yoluyla incelenen otofagozomlar ve otofagolizozomların ultra ince kesitlerle incelenmesi şeklinde morfolojik olarak analiz edilir. Lizozomun membran yapısı şekil ve içerik farklılıklarından kaynaklanan görüntülerin yorumlanması deneyim gerektiren bir işlemdir. Otofagosom, lizozom ile kaynaşmadan önce 10 dakikadan daha az bir süre geçici bir organel olup çeşitli bozunma aşamalarında otofagolizozomların ortaya çıkmasına neden olur. Bu durum otofajinin biyokimyasal çalışması da araştırmacılar için önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Fakat en önemli problem morfolojik ve biyokimyasal çalışmalar için otofagozom veya otofagolizozomun spesifik bir belirtecinin olmamasıydı[1] .

Şekil 7: Otofaji mekanizmasında kullanılan proteinlerin ve hücre organellerinin işlevini gösteriyor [3A].

KAYNAKÇA

[1] Ohsumi,Y.(2014), “Historical landmarks of autophagy research” ,Cell Research, 24:9–23
[2] Rogers,L., “Lysosome,Britannica Web (20.06.2020 tarihinde erişilmiştir.)
[3] Pathol, J., Glick, D., Barth, S., and Kay F. (2010), Autophagy: cellular and molecular mechanisms,221(1): 3–12.
[4] Yoshinori Ohsumi Biography,The Nobel Prize.
[5] Karol,S., Suludere,Z., Ayvalı,C. (2010), “Biyoloji Terimleri Sözlüğü”, Ankara : Türk Dil Kurumu, 5.Baskı, s.493

ŞEKİLLER VE GRAFİKLER

[1.A] Yoshinori Oshumi,Press Release of Award.
[2A] Yin,X.M.,Ding,W.X., Gao,W. (2008), “Autophagy in the liver”,Hepatology, 47;5.
[3A] Dikic, I., & Elazar, Z. (2018), “Mechanism and medical implications of mammalian autophagy”, Nature reviews. Molecular cell biology19(6), 349–364.